在普通寬視野光學顯微鏡中，整個標本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察，同時，來自焦點以外的其他區(qū)域的熒光對結構的干擾較大，尤其是標本的厚度在 2um 以上時，其影響更為明顯。

激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。醫(yī)學教育|網(wǎng)搜集整理 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像。在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。 以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。